NGUYÊN LÝ
Mục đích
Định danh mọi căn nguyên vi khuẩn gây bệnh đến mức độ chi và hoặc loài.
Nguyên lý
Định danh chính xác các loại vi khuẩn dựa trên trình tự nucleotide đặc trưng của gene mã hóa cho 16S rRNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự gene.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn Sinh học cấp 2.
Máy PCR.
Máy đọc điện di.
Máy giải trình tự gen.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Micropipette.
Bộ lưu điện.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao [bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm]
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 3 mẫu/lần thực hiện [VD].
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm [QC] là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao [với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật].
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm [EQAS] là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao [với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm].
Bệnh phẩm
Chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh [Xem phụ lục 3].
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết DNA tổng số.
Thực hiện PCR gene 16S ARN ribosome.
Điện di kiểm tra sản phẩm.
Giải trình tự gene.
Kiểm tra độ tương đồng DNA.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gene đích được so sánh với các trình tự của gene mã hóa cho 16S rRNA có trên “Genebank” để định danh căn nguyên vi khuẩn cần xác định. Trình tự nucleotide phải có độ tương đồng ≥ 97% mới có thể kết luận được đến mức độ chi và/hoặc loài.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại.
Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
What Are 16S and ITS rRNA Sequencing?
16S and Internal Transcribed Spacer [ITS] ribosomal RNA [rRNA] sequencing are common amplicon sequencing methods used to identify and compare bacteria or fungi present within a given sample. Next-generation sequencing [NGS]-based ITS and 16S rRNA gene sequencing are well-established methods for comparing sample phylogeny and taxonomy from complex microbiomes or environments that are difficult or impossible to study.
The prokaryotic 16S rRNA gene is approximately 1500 bp long, with nine variable regions interspersed between conserved regions. Variable regions of the 16S rRNA gene are frequently used for phylogenetic classification of genus or species in diverse microbial populations.1 The ITS1 region of the rRNA cistron is a commonly used DNA marker for identifying fungal species in metagenomic samples.2
16S Sequencing Method Guide
Amplicon-based next-generation sequencing of the 16S gene offers several advantages over capillary sequencing or PCR-based approaches. Learn how it works with this guide to 16S sequencing methods.
Advantages of NGS-Based ITS and 16S rRNA Analysis
A key benefit of 16S and ITS ribosomal RNA NGS methods is that they provide a cost-effective technique to identify strains that may not be found using traditional methods. Unlike capillary sequencing or PCR-based approaches, next-generation sequencing is a culture-free method that enables analysis of the entire microbial community within a sample.
16S rRNA NGS allows microbiologists to achieve genus-level sensitivity for metagenomic surveys of bacterial populations. ITS analysis with NGS enables rapid fungal identification to help advance our understanding of the mycobiome. Furthermore, NGS offers the ability to combine multiple samples in a sequencing run.
Scientists Discuss 16S rRNA Sequencing
The Saca la Lengua project used 16S and 18S rRNA sequencing to identify the bacteria and fungi that live in the human mouth.
Read InterviewMichael Bunce, PhD uses next-generation sequencing and metabarcoding methods to study environmental DNA [eDNA].
Read InterviewPhil Hugenholtz, PhD explains the difference between 16S rRNA and shotgun metagenomic sequencing, and describes how NGS has made a difference in his research.
Read Interview
Applications of 16S and ITS rRNA Sequencing
Using the 16S metagenomics workflow with the iSeq 100 System, you can achieve genus-level sensitivity for surveys of bacterial populations.
Read Application Note
Get genus-level detection of fungi in diverse sample types with the ITS metagenomics workflow.
Read Application Note
Demonstrated 16S and ITS rRNA NGS Protocols
Workflow for ITS and 16S rRNA Sequencing
Illumina offers products to support NGS-based 16S and ITS rRNA analysis studies, from library preparation to data analysis and interpretation. Our user-friendly workflow can help take the guesswork out of your experiments.
Click on the below to view products for each workflow step.
Interested in receiving newsletters, case studies, and information on microbial genomics? Enter your email address.
The iSeq 100 System makes next-generation sequencing easier and more affordable than ever.
Learn More
The MiSeq benchtop sequencer enables targeted and microbial genome applications, with high-quality sequencing, simple data analysis, and cloud storage.
Learn More
Prepare sequencing libraries for small genomes, amplicons, plasmids, and other applications.
View Product
Illumina NGS is enabling "citizen science" metagenomics studies of the human microbiome.
View Video
 
A detailed look at our demonstrated 16S rRNA analysis workflow, including data visualization and success stories.
View Video