Các phương pháp xác định vi sinh vật phi văn hóa

Giới thiệu

Enzyme đã được sử dụng ngày càng nhiều trong nhiều ứng dụng công nghiệp vì các đặc tính nổi bật của chúng, chẳng hạn như tính đặc hiệu của cơ chất và hoạt tính cao, dưới các giá trị pH, nhiệt độ và áp suất nhẹ. Hầu hết các enzyme có nguồn gốc từ các vi khuẩn môi trường và các enzyme có giá trị công nghiệp thường được xác định ở các vi khuẩn mới. Tuy nhiên, những nguồn tài nguyên như vậy không thể được tiếp cận hoàn toàn bằng các phương pháp dựa trên nuôi cấy vì phần lớn vi khuẩn không thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm

Để khắc phục hạn chế này, metagenomics, bao gồm phân tích bộ gen độc lập với văn hóa của cộng đồng vi sinh vật, đã được áp dụng để tiếp cận các nguồn gen rộng lớn chưa được khai thác. Trong các phương pháp metagenomic, hai chiến lược thường được sử dụng để sàng lọc và xác định các gen mới từ các thư viện DNA môi trường. sàng lọc dựa trên trình tự và dựa trên hoạt động,. Sàng lọc dựa trên trình tự đã dẫn đến việc xác định hiệu quả các gen mã hóa enzyme dựa trên tương đồng trình tự. Đặc biệt, những phát triển gần đây trong công nghệ giải trình tự thông lượng cao đã nâng cao đáng kể quá trình sàng lọc dựa trên trình tự. Tuy nhiên, chi phí vận hành để giải trình tự để thu được lượng lớn dữ liệu giải trình tự vẫn còn cao và việc lắp ráp trình tự đòi hỏi thời gian tính toán lâu. Ngược lại, sàng lọc dựa trên hoạt động yêu cầu nhân bản các đoạn DNA môi trường thành các vectơ để sàng lọc các dòng thể hiện hoạt tính enzym đã chọn. Tuy nhiên, ai cũng biết rằng phương pháp này bị cản trở bởi các vấn đề về biểu hiện gen ở các vật chủ dị loại. Ngoài ra, một số lượng nhỏ các dòng vô tính thể hiện hoạt tính enzym đã chọn phải được chọn từ một số khuẩn lạc [ví dụ:. g. 4 lượt truy cập từ 389.000 bản sao]. Trong cả sàng lọc dựa trên trình tự và hoạt động, về mặt kỹ thuật, rất khó để thu được các gen mã hóa enzyme từ các tế bào vi sinh vật hiếm gặp trong môi trường vì các gen hiện diện gần như tỷ lệ thuận với tần số quần thể của mỗi vi khuẩn.

Bộ gen đơn bào là một kỹ thuật mới nổi mạnh mẽ, cho phép mô tả đặc tính độc lập với nuôi cấy của các tế bào vi sinh vật chưa được nuôi cấy,,,,,. Nó liên quan đến việc phân lập tế bào đơn lẻ, tiếp theo là khuếch đại toàn bộ bộ gen và giải trình tự. Kết hợp với sàng lọc dựa trên tế bào đơn cho hoạt động của enzyme, chiến lược bộ gen đơn bào sẽ là một phương pháp đầy hứa hẹn để xác định các gen mã hóa enzyme mới từ các vi khuẩn môi trường, bao gồm các tế bào vi khuẩn quý hiếm và chưa được nuôi cấy, mà không cần nuôi cấy trước. Phân loại tế bào được kích hoạt bằng huỳnh quang [FACS] là phương pháp thông lượng cao được sử dụng phổ biến nhất để phân tách các tế bào vi khuẩn riêng lẻ,,,,. Tuy nhiên, FACS có một số vấn đề kỹ thuật đối với việc phân loại tế bào vi sinh vật. Do thiếu xác nhận trực quan về nhận dạng tế bào, các hạt huỳnh quang không tế bào có trong các mẫu môi trường có thể được sắp xếp cùng với các tế bào vi sinh vật được nhắm mục tiêu,. Ngoài ra, FACS duy trì hiệu quả thấp trong việc khôi phục các ô hiếm vì nó yêu cầu kiểm tra trực quan và chọn thủ công các phép chiếu một hoặc hai chiều của dữ liệu để xác định các tập hợp con ô quan tâm,

Ở đây chúng tôi trình bày một phương pháp tiếp cận phương pháp để xác định các gen mã hóa các enzyme hoạt động trao đổi chất trong các vi khuẩn môi trường bằng cách kết hợp sàng lọc đơn bào dựa trên hoạt động bằng cách sử dụng microdroplets và giải trình tự bộ gen đơn bào []. Mặc dù dựa trên sự kết hợp của các quy trình đã được thiết lập trước đó, nhưng phương pháp này có thể được coi là phiên bản mở rộng của quá trình ngăn cách trong ống nghiệm, sử dụng quá trình ngăn cách để liên kết kiểu gen và kiểu hình,,. Là một thử nghiệm chứng minh khái niệm, chúng tôi đã áp dụng phương pháp của mình để thu được các gen-glucosidase [BGL] mới từ vi khuẩn trong các mẫu nước biển. Chúng tôi đã xác định được 14 gen BGL mới từ các tế bào vi khuẩn biển chưa được nuôi cấy

Hình 1

Sơ đồ quy trình công việc để xác định các gen mã hóa enzyme của vi sinh vật bằng cách giải trình tự tế bào đơn dựa trên hoạt động bằng cách sử dụng microdroplets

[a] Quy trình công việc bao gồm phân lập tế bào vi sinh vật đơn lẻ trong các giọt siêu nhỏ W/O [bước 1], sàng lọc và phục hồi tế bào đơn dựa trên hoạt động [bước 2], khuếch đại toàn bộ bộ gen [bước 3] và giải trình tự bộ gen [bước 4 . Các gen mã hóa các enzym đích được xác định dựa trên thông tin bộ gen [bước 5]. Toàn bộ quá trình có thể được hoàn thành trong 4–5 ngày. [ b ] Biểu diễn sơ đồ phân lập tế bào vi sinh vật đơn lẻ trong các microdroplet W/O bằng thiết bị vi lỏng. [ c ] Biểu diễn sơ đồ sàng lọc và phục hồi tế bào đơn dựa trên hoạt động của các tế bào đích

Hình ảnh kích thước đầy đủ

phương pháp

Chuẩn bị mẫu môi trường

Nước biển bề mặt được thu thập từ bờ biển vịnh Tokyo, Nhật Bản [35° 19. 170′ Bắc, 139° 39. 068′ E] vào tháng 3 năm 2014. Nước biển bề mặt được đưa qua bộ lọc lưới nylon 41 μm [Merck Millipore] để tách các hạt và mảnh vụn lớn. Phần dịch chiết [xấp xỉ 100 mL] được cô đặc đến khoảng 9 mL [xấp xỉ 11 lần] bằng siêu lọc ly tâm sử dụng màng lỗ 10 kDa [Amicon Ultra-15, Merck Millipore]. Nước biển sâu được lấy ở độ sâu 857 m ngoài khơi đảo Hatsushima, vịnh Sagami, Nhật Bản [35° 0. 948′ Bắc, 139° 13. 310′ E] vào tháng 4 năm 2014. Nước biển sâu được đưa qua bộ lọc lưới nylon 20 μm [Merck Millipore] và bộ lọc màng Omnipore 10 μm [Merck Millipore]. Phần dịch chiết [khoảng 200 mL] được cô đặc đến khoảng 0. 5 mL [xấp xỉ 400 lần] bằng siêu lọc ly tâm. Quá trình siêu lọc được thực hiện ở mức 5.000 g trong 1–2 h ở 4 °C

Tạo ra các microdroplets nước trong dầu

Các hạt nhỏ giọt nước trong dầu [W/O] được tạo ra bằng thiết bị vi lỏng có dạng hình học tập trung vào dòng chảy, bao gồm hai kênh giao nhau theo hình chữ thập []. Chiều rộng của các kênh chính là 100 μm và chiều rộng tại các điểm hạn chế tập trung dòng chảy là 40 μm. Chiều cao của tất cả các kênh là 50μm. Thiết bị được chế tạo từ polydimethylsiloxane [PDMS] bằng cách sử dụng các kỹ thuật sao chép khuôn và in thạch bản mềm tiêu chuẩn, như được mô tả ở nơi khác. Tóm lại, nền PDMS và chất đóng rắn [SILPOT 184 W/C, Dow Corning Toray] được trộn ở nhiệt độ 10. Tỷ lệ 1 [w/w], khử khí, đổ lên khuôn chính và nung ở 110 °C trong 1 h. Sau khi niêm phong thiết bị PDMS bằng lớp phủ, bề mặt kênh được xử lý bằng dung dịch 0. 1% [heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl]dimethylchlorosilane [Gelest] trong ethanol, sau đó rửa bằng ethanol. Thiết bị vi lỏng sau đó được nung ở 80 °C trong 1 h. Phương pháp xử lý này là cần thiết để làm ướt ưu tiên dung dịch dầu [xem bên dưới] trên các thành kênh để tạo ra các giọt nhỏ W/O ổn định

Dung dịch nước bao gồm mẫu nước biển đậm đặc [khoảng 1 × 107 tế bào/mL] chứa 2 mM fluorescein di-β-D-glucopyranoside [FDGlu; Marker Gene Technologies], trong khi dung dịch dầu bao gồm dầu khoáng [Sigma-Aldrich] . Dung dịch [dung dịch nước. 20 μL; . 100 μL] được bơm vào kênh bằng áp suất không khí [15 kPa đối với dung dịch nước; 40 kPa đối với dung dịch dầu] để tạo ra các giọt siêu nhỏ W/O đường kính 25 μm trong 30 phút ở 60 Hz. Trong quá trình hoạt động, microdevices được giữ lạnh bằng nước đá. Hoạt động được tiến hành bằng phần mềm tùy chỉnh, được viết bằng Visual Basic. MẠNG 2010 [Microsoft]

kính hiển vi

Quá trình tạo microdroplet được theo dõi thông qua một vật kính [UPlanApo 20 ×/0. 70 NA, Olympus] bằng máy ảnh tốc độ cao [LRH2500XE, Digimo] gắn trên kính hiển vi đảo ngược [IX-71, Olympus]

Các tế bào vi sinh vật được quan sát bằng kính hiển vi đảo ngược [IX71, Olympus] với vật kính ngâm dầu [UPlanApo 40 ×/1. 00 NA Oil Iris, Olympus], đèn xenon và bộ lọc để quan sát huỳnh quang từ 4′,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI] [bộ lọc kích thích, FF01-357/44-25 [Semrock]; . Các hình ảnh trường sáng và huỳnh quang được chụp bằng máy ảnh CCD nhân điện tử [C9100-13, Hamamatsu Photonics]. Nồng độ tế bào vi sinh vật được ước tính bằng nhuộm DAPI [3 μg/mL, Polyscatics] và đếm trực tiếp bằng kính hiển vi phát huỳnh quang

Thu thập các giọt siêu nhỏ và phục hồi vi khuẩn thể hiện hoạt động BGL

Các giọt nhỏ được mạ trên đĩa thủy tinh 35 mm [đế thủy tinh 12 mm, IWAKI] bằng dầu khoáng chứa 4% [v/v] ABIL EM90 và được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Mỗi microdroplet chứa một tế bào vi khuẩn huỳnh quang cho thấy hoạt động BGL đã được chọn và chuyển vào nắp của ống PCR chứa đầy 10 μL dầu khoáng bằng cách sử dụng một máy vi thao tác [CellTram vario, Eppendorf] được trang bị một mao quản thủy tinh có góc cạnh [50 μm . Các tế bào đã được phục hồi từ các giọt nhỏ trong 4 μL dung dịch muối đệm phốt phát bằng cách ly tâm [khoảng 4.000 rpm] bằng máy ly tâm để bàn [Cubee, Recenttec Inc. ]

Khuếch đại toàn bộ bộ gen

Quá trình khuếch đại toàn bộ bộ gen được thực hiện dựa trên kỹ thuật khuếch đại đa dịch chuyển [MDA], sử dụng Bộ tế bào đơn REPLI-g [QIAGEN]. Tóm lại, các tế bào riêng lẻ được ly giải bằng dung dịch kiềm, sau đó trung hòa và DNA bộ gen được khuếch đại bằng cách sử dụng phi29 DNA polymerase ở 30 °C trong 8 h. Không thực hiện xử lý khử nhiễm thuốc thử khuếch đại và đồ dùng một lần. Để xác nhận sự khuếch đại thành công bộ gen từ các tế bào vi khuẩn bị cô lập, 1-μL các sản phẩm MDA pha loãng 20 lần được dùng làm mẫu cho PCR gen 16S rRNA của vi khuẩn. PCR được thực hiện bằng cách sử dụng Tks Gflex DNA Polymerase [Takara Bio] và các mồi vi khuẩn phổ biến 27F [5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′] và 1492R [5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′] như sau. 96 °C trong 2 phút và 25 chu kỳ 98 °C trong 10 s, 52 °C trong 15 s và 68 °C trong 90 s. Các sản phẩm được phân tích bằng điện di trên gel agarose được nhuộm bằng SYBR Safe [Life Technologies]. Các bộ khuếch đại đã được tinh chế [NucleoSpin Gel và PCR Clean-up, Macherey-Nagel GmbH & Co. KG] và được giải trình tự trực tiếp bằng phương pháp Sanger

Giải trình tự và chú thích bộ gen

Các sản phẩm MDA kết quả đã được trực tiếp trải qua toàn bộ trình tự bộ gen. Trình tự được thực hiện trên trình sắp xếp Ion Torrent PGM [Life Technologies] được trang bị chip 318 sử dụng hóa học 400 cơ sở. Trình tự đọc được lắp ráp bằng SPAdes 3. 5. 0. Các gen mã hóa BGL được xác định bằng tìm kiếm BLAST dựa vào UniProt [http. //www. đơn nguyên. org/] và CAZy [http. //www. buồn cười. tổ chức/; . ] cơ sở dữ liệu. Trình tự mã hóa BGL đã được xác nhận bằng cách sử dụng trình tự Sanger

Số gia nhập trình tự

Trình tự gen 16S rRNA thu được trong nghiên cứu này đã được ký gửi tại DDBJ/EMBL/GenBank dưới các số bổ sung LC075346 [SAG_A], LC075347 [SAG_B], LC075348 [SAG_C], LC075349 [SAG_D], LC075350 [SAG_E] và LC075351 [SAG_F]. Trình tự gen BGL được ký gửi dưới các số gia nhập LC088483 [BGL1B1], LC088484 [BGL3B1], LC088485 [BGL1C1], LC088486 [BGL3C1], LC088487 [BGL3C2], LC088488 [BGL1D1], LC088489 [BGL3D1] LC088490 [BGL8E491], LC0

Kết quả và thảo luận

thiết kế phương pháp

Một biểu diễn sơ đồ của phương pháp của chúng tôi được hiển thị trong. Đầu tiên, bằng cách sử dụng thiết bị vi lỏng, các vi khuẩn môi trường được gói gọn ở cấp độ đơn tế bào trong các giọt nhỏ giọt W/O cỡ picolit, là các giọt nhỏ chứa nước phân tán trong dầu, với chất nền fluorogen cho enzyme đích [, bước 1 và ]. Các hệ thống vi lỏng cho phép sản xuất các giọt nhỏ có kích thước đồng nhất và phân lập nhanh chóng các tế bào đơn lẻ trong các ngăn riêng lẻ,,. Sau khi ủ ở nhiệt độ môi trường, các giọt nhỏ được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang để sàng lọc và thu thập những giọt chứa vi khuẩn huỳnh quang thể hiện hoạt tính enzym được chọn. Cách tiếp cận này cho phép phân lập cụ thể các tế bào vi sinh vật được nhắm mục tiêu, mặc dù chúng hiện diện với số lượng tương đối thấp trong môi trường. Mỗi tế bào vi khuẩn huỳnh quang được phục hồi từ các giọt nhỏ giọt bằng cách ly tâm [, bước 2 và ] và sau đó được khuếch đại toàn bộ bộ gen bằng cách sử dụng MDA với phi29 DNA polymerase, [, bước 3]. MDA là phương pháp ưa thích để khuếch đại toàn bộ bộ gen của các tế bào đơn lẻ và đã kích hoạt thành công việc phục hồi bộ gen một phần và gần như hoàn chỉnh của vi khuẩn từ nhiều môi trường khác nhau,,,,,. Cuối cùng, các sản phẩm MDA thu được đã được giải trình tự thông lượng cao [, bước 4] và dữ liệu trình tự được phân tích theo dạng tin sinh học để xác định các gen mã hóa enzyme đích [, bước 5]

Xác định gen BGL mới từ vi khuẩn môi trường

Chúng tôi đã áp dụng phương pháp của mình để thu được các gen BGL mới từ vi khuẩn trong nước biển được thu thập từ hai địa điểm khác nhau. nước biển bề mặt và nước biển sâu. BGL [EC 3. 2. 1. 21] được tìm thấy trong tất cả các lĩnh vực của sinh vật sống và thủy phân các liên kết β-glycosid của oligosacarit, cũng như của alkyl- và aryl β-glucoside. Dựa trên sự giống nhau trong trình tự axit amin của chúng, BGL chủ yếu được phân loại thành họ glycoside hydrolase 1 [GH1] và họ 3 [GH3] của cơ sở dữ liệu CAZy. BGL có nhiều ứng dụng tiềm năng trong các quy trình công nghệ sinh học khác nhau, chẳng hạn như sản xuất etanol sinh học và tổng hợp oligosacarit,

Lúc đầu, để kiểm tra tỷ lệ xuất hiện của các tế bào vi khuẩn hoạt động với BGL, nước biển bề mặt được trộn với FDGlu, một chất nền phát huỳnh quang cho BGL. FDGlu là một phân tử không huỳnh quang thấm qua màng. Khi FDGlu xâm nhập vào tế bào vi khuẩn biểu hiện BGL, nó bị thủy phân để tạo ra fluorescein, chất này được giữ lại bên trong tế bào,. Khoảng 2% ô được coi là hoạt động BGL, cho thấy rằng một số lượng lớn ô có ít hoặc không có hoạt động BGL []

Tiếp theo, bằng cách sử dụng các thiết bị vi lỏng có điểm nối tập trung dòng chảy [ ], các tế bào vi khuẩn trên bề mặt và nước biển sâu được bao bọc bằng FDGlu trong các giọt siêu nhỏ W/O [đường kính, khoảng 25 μm; thể tích, khoảng 8 pL]. Quá trình đóng gói tế bào tuân theo phân phối Poisson như đã báo cáo trước đây. Để đạt được sự đóng gói tế bào hiệu quả và để tránh tạo ra một số lượng lớn các giọt siêu nhỏ rỗng, các tế bào vi khuẩn trong các mẫu nước biển được cô đặc đến khoảng 1 × 107 tế bào/mL bằng siêu lọc ly tâm. Siêu lọc không có ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ xuất hiện của tế bào vi khuẩn huỳnh quang []. Trong những điều kiện này, các tế bào vi khuẩn được đóng gói ở cấp độ một tế bào trên mười microdroplet, đảm bảo rằng một số microdroplet chứa nhiều tế bào. Trong tổng số khoảng 2 × 105 giọt nhỏ giọt có hoặc không có tế bào vi khuẩn, khoảng 2 × 103 giọt nhỏ được sàng lọc dưới kính hiển vi huỳnh quang trong vòng 2 giờ. Tổng cộng có chín microdroplets chứa các tế bào vi khuẩn phát huỳnh quang đơn lẻ được thu thập bằng cách sử dụng các mao quản thủy tinh được gắn vào một bộ vi xử lý và mỗi tế bào được ly giải và chịu MDA. Để xác nhận quá trình khuếch đại bộ gen thành công từ từng tế bào vi khuẩn đơn lẻ được phân lập từ các mẫu môi trường của chúng tôi, các bộ khuếch đại gen 16S rRNA có nguồn gốc từ mỗi sản phẩm MDA đã được giải trình tự. Hai trong số bốn sản phẩm MDA từ nước biển bề mặt [, làn 2 và 4] và bốn trong số năm sản phẩm MDA từ nước biển sâu [, làn 5 và 7–9] đã tạo ra các bộ khuếch đại. Trình tự trực tiếp của các bộ khuếch đại PCR đã chứng minh rằng bộ gen từ mỗi tế bào vi khuẩn được nhắm mục tiêu đã được khuếch đại thành công; . Các sản phẩm MDA dương tính với PCR được gọi là bộ gen khuếch đại đơn [SAG]. SAG_A, SAG_B, SAG_C, SAG_D, SAG_E và SAG_F. Sáu SAGes là trình tự súng ngắn, lắp ráp và phân tích. Trình tự và kết quả lắp ráp de novo được tóm tắt trong. SAG_B–SAG_F chứa 5 gen mã hóa giả định GH1 BGL và 8 gen mã hóa GH3 BGL giả định, trong khi SAG_A không chứa gen BGL []. Điều này có thể là do không thể phục hồi một số vùng nhất định của trình tự bộ gen do sai lệch khuếch đại trong MDA []. Ở 12 trong số 14 gen thu được, các trình tự axit amin được suy luận tương đối độc đáo, thể hiện 52–74% trình tự axit amin giống hệt với các BGL giả định được tìm thấy trong cơ sở dữ liệu công cộng []

Bảng kích thước đầy đủ

Bảng kích thước đầy đủ

Bảng kích thước đầy đủ

Bảng kích thước đầy đủ

Hình 2

Phân lập và khuếch đại bộ gen của vi khuẩn thể hiện hoạt động BGL từ nước bề mặt và nước biển sâu

[a] Hình ảnh trường sáng [trái] và huỳnh quang [phải] của các vi giọt nhỏ W/O bao bọc vi khuẩn môi trường bằng FDGlu. Đầu mũi tên màu trắng cho thấy một tế bào vi khuẩn phát huỳnh quang trong một microdroplet W/O. Thanh tỷ lệ đại diện cho 20 μm. [b] Khuếch đại PCR gen 16S rRNA từ các sản phẩm MDA. Các bộ khuếch đại được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1% và nhuộm bằng SYBR Safe. Kích thước khuếch đại ước tính là khoảng 1.466 bp. Ngõ M, điểm đánh dấu DNA [λ-EcoT14 tôi tiêu hóa]; . 1–4], ngõ 5–9, các sản phẩm MDA từ nước biển sâu [Droplet No. 5–9]

Hình ảnh kích thước đầy đủ

Sau đó, chúng tôi đã chuẩn bị các BGL GH1 tái tổ hợp [BGL1B1, BGL1C1, BGL1E1 và BGL1E2] để xác nhận xem các gen đã xác định các protein mã hóa có hoạt động BGL hay không. Các hoạt động BGL của chúng được kiểm tra với chất nền tạo màu cho BGL, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside [pNPG], ở 30 °C []. BGL1C1 và BGL1E2 ít hoạt động hơn đáng kể so với pNPG so với BGL1B1 và ​​BGL1E1 []. Các thông số động học của BGL1B1 và ​​BGL1E1 tương đương hoặc lớn hơn các thông số động học của GH1 BGL có nguồn gốc từ metagenome trong môi trường có vi khuẩn sản xuất BGL sinh sống,,,

cân nhắc về phương pháp luận

Chúng tôi đã sử dụng một xét nghiệm fluorogen nhạy cảm để sàng lọc các tế bào vi khuẩn thể hiện hoạt động BGL trong các giọt nhỏ. Chúng tôi cũng đã chứng minh việc phát hiện thành công một số hoạt động enzyme của các tế bào vi sinh vật riêng lẻ bằng cách sử dụng chất nền fluorogen tương ứng trong các giọt nhỏ []. Các giọt nhỏ có thể giữ lại các sản phẩm huỳnh quang khuếch tán tự do ra khỏi tế bào và cho phép sàng lọc các enzym được tiết ra. Nếu sử dụng chất nền fluorogen không thấm qua tế bào hoặc xét nghiệm enzyme kết hợp, tế bào vi sinh vật phải được ly giải bằng chất tẩy rửa trong các giọt nhỏ, như đã mô tả trước đây. Ngoài phát hiện huỳnh quang, các kỹ thuật phát hiện khác, chẳng hạn như độ hấp thụ, phát hiện tán xạ Raman và điện hóa, tương thích với sàng lọc dựa trên vi giọt nước, mặc dù chúng kém nhạy hơn so với phát hiện huỳnh quang. Do đó, một loạt các hoạt động enzym có thể được thử nghiệm trong các giọt siêu nhỏ để xác định các gen

Ngoài ra, phương pháp của chúng tôi có những lợi thế tiềm năng quan trọng trong hai khía cạnh cơ bản của bộ gen đơn bào. sự phân lập và khuếch đại bộ gen của các tế bào vi sinh vật đơn lẻ. Đầu tiên, phương pháp của chúng tôi có khả năng phân lập cụ thể các tế bào vi sinh vật được nhắm mục tiêu. FACS là phương pháp thông lượng cao được sử dụng phổ biến nhất để tách các tế bào vi khuẩn riêng lẻ,,,,. Tuy nhiên, các mẫu môi trường chứa các hạt huỳnh quang không tế bào, có thể được sắp xếp với các tế bào vi sinh vật được nhắm mục tiêu,. Hơn nữa, rất khó để phân lập các tế bào vi sinh vật hiếm từ môi trường vì các hệ thống FACS thông thường chỉ thu thập các tế bào có tỷ lệ >0. 1%,. Mặc dù phương pháp của chúng tôi có thông lượng tương đối thấp so với phương pháp FACS, nhưng nó cho phép đánh giá trực quan các ô đơn lẻ trong quá trình sàng lọc và các ô hiếm có thể bị loại trừ trong hệ thống FACS có thể được phục hồi. Có thể thu thập các giọt nhỏ giọt bằng vi thao tác sử dụng các mao quản siêu nhỏ và các tế bào vi sinh vật được bao bọc có thể dễ dàng phục hồi từ các giọt nhỏ giọt bằng cách ly tâm bằng máy ly tâm để bàn []. Thứ hai, phương pháp của chúng tôi có khả năng làm giảm ô nhiễm với các vi khuẩn không phải mục tiêu và DNA được đưa vào thông qua xử lý mẫu []. Trong bộ gen đơn bào của vi sinh vật, một trong những vấn đề nghiêm trọng nhất là sự nhiễm bẩn; . Vấn đề ô nhiễm hầu như đã được giải quyết bằng cách đưa ra một môi trường được kiểm soát chặt chẽ, chẳng hạn như phòng sạch, sử dụng robot xử lý chất lỏng và các nền tảng vi lỏng chuyên dụng cao,,. Ngược lại, nguy cơ nhiễm bẩn có thể giảm bằng cách giới hạn mẫu ban đầu vào các giọt siêu nhỏ W/O có thể tích vài picolit. Ngoài ra, dầu bao quanh mỗi microdroplet hoạt động như một rào cản, ngăn chặn nhiễu xuyên âm giữa các tế bào và ô nhiễm từ các nguồn bên ngoài. Từ góc độ thực tế của chúng tôi, phương pháp của chúng tôi có thể được thực hiện trong phòng thí nghiệm sinh học tiêu chuẩn với các thiết bị phổ biến hiện có

Chúng tôi đã xác định các gen BGL thông qua phương pháp tiếp cận dựa trên trình tự, dựa trên phân tích trình tự để cung cấp cơ sở cho các dự đoán về chức năng. Tuy nhiên, nó có thể không xác định được các gen được chọn không biểu hiện sự tương đồng về trình tự với các gen đã biết. Trong trường hợp này, cách tiếp cận dựa trên hoạt động sẽ có lợi; . Cách tiếp cận này phù hợp hơn để thu được các gen có hoạt tính enzym đích và cho phép xác định các enzym mới không có hoặc có ít tương đồng với các enzym đã biết, trong khi yêu cầu biểu hiện chức năng quan tâm trong các vật chủ dị loại [e. g. Escherichia coli] hoặc hệ thống dịch mã phiên mã in vitro. Hơn nữa, phương pháp của chúng tôi có thể cung cấp thông tin toàn diện hơn về mạng lưới di truyền và con đường trao đổi chất của từng tế bào vi sinh vật so với các phương pháp metagenomic thông thường. Do đó, nó tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định các cụm gen mã hóa các enzyme hoạt động trao đổi chất

thông tin thêm

Làm thế nào để trích dẫn bài viết này. Nakamura, K. et al. Phương pháp độc lập với văn hóa để xác định các gen mã hóa enzyme của vi sinh vật bằng cách giải trình tự tế bào đơn dựa trên hoạt động bằng cách sử dụng nền tảng vi giọt nước trong dầu. Khoa học. Trả lời. 6, 22259; . 10. 1038/srep22259 [2016]

Người giới thiệu

• Sánchez, S. & Demain, A. l. Enzyme và chuyển đổi sinh học có ý nghĩa công nghiệp, dược phẩm và công nghệ sinh học. tổ chức. Tiến trình. độ phân giải. nhà phát triển. 15, 224–230 [2011]

  CAS  Google Scholar

• Riesenfeld, C. S. , Schloss, P. D. & Handelsman, J. Metagenomics. phân tích bộ gen của các cộng đồng vi sinh vật. hàng năm. Tái bản. gen. 38, 525–552 [2004]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Iqbal, H. Một. , Feng, Z. & Brady, S. F. Các chất xúc tác sinh học và các sản phẩm phân tử nhỏ từ các nghiên cứu metagenomic. cà ri. ý kiến. hóa. Sinh học. 16, 109−116 [2012]

  CAS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Lorenz, P. & Eck, J. Metagenomics và ứng dụng công nghiệp. tự nhiên. Tái bản. vi sinh vật. 3, 510−516 [2005]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Uchiyama, T. & Miyazaki, K. Metagenomics chức năng để khám phá enzyme. những thách thức để sàng lọc hiệu quả. cà ri. ý kiến. công nghệ sinh học. 20, 616–622 [2009]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Scholz, M. b. , Lộ , C. C. & Chuỗi, P. S. Trình tự thế hệ tiếp theo và tắc nghẽn tin sinh học. tình trạng hiện tại của phân tích dữ liệu metagenomic. cà ri. ý kiến. công nghệ sinh học. 23, 9−15 [2012]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Waschkowitz, T. , Rockstroh, S. & Daniel, R. Phân lập và mô tả đặc điểm của metallicoprotease với cấu trúc miền mới bằng cách xây dựng và sàng lọc các thư viện metagenomic. ứng dụng. môi trường. vi sinh vật. 75, 2506–2516 [2011]

  Google học giả

• Marcy, Y. et al. Phân tích “vật chất tối” sinh học bằng phân tích di truyền đơn bào của các vi khuẩn TM7 quý hiếm và chưa được nuôi cấy từ miệng người. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 104, 11889−11894 [2007]

  CAS  ADS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• thiên nga, B. K. et al. Tiềm năng hóa hóa tự dưỡng giữa các dòng vi khuẩn phổ biến trong đại dương tối. Khoa học 333, 1296−1300 [2011]

  CAS  ADS  PubMed  Google Scholar

• Dupont, C. l. et al. Những hiểu biết về bộ gen đối với SAR86, một dòng vi khuẩn biển phong phú và chưa được khai thác. ISME J. 6, 1186−1199 [2012]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• McLean, J. S. et al. Bộ gen TM6 của ngành ứng cử viên được phục hồi từ màng sinh học trong bồn rửa của bệnh viện cung cấp những hiểu biết về bộ gen đối với ngành chưa được canh tác này. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Mỹ 110, E2390−2399 [2013]

  CAS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Rink, C. et al. Hiểu biết sâu sắc về tiềm năng phát sinh gen và mã hóa của vật chất tối của vi sinh vật. Tự nhiên 499, 431−437 [2013]

  CAS  ADS  PubMed  Google Scholar

• Wilson, M. C. et al. Một đơn vị phân loại vi khuẩn môi trường với tiết mục trao đổi chất lớn và khác biệt. Thiên nhiên 506, 58–62 [2014]

  CAS  ADS  PubMed  Google Scholar

• Davey, H. m. & Kell, D. b. Dòng tế bào học và phân loại tế bào của quần thể vi sinh vật không đồng nhất. tầm quan trọng của các phân tích đơn bào. vi sinh vật. Tái bản. 60, 641−696 [1996]

  CAS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Müller, S. & Nebe-von-Caron, G. Phân tích đơn bào chức năng. tế bào học dòng chảy và phân loại tế bào của quần thể và cộng đồng vi sinh vật. vi sinh FEMS. Tái bản. 34, 554−587 [2010]

  PubMed  Google Scholar

• Yamamura, S. et al. Microarray đơn bào để phân tích phản ứng của tế bào. hậu môn. hóa. 77, 8050–8056 [2005]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Yoshimoto, N. et al. Một hệ thống tự động để nhân giống dựa trên tế bào đơn thông lượng cao. Khoa học. Trả lời. 3, 1191 [2013]

  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Tawfik, D. S. & Griffiths, A. D. Các ngăn giống như tế bào nhân tạo cho quá trình tiến hóa phân tử. tự nhiên. công nghệ sinh học. 16, 652–656 [1998]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Mastrobattista, E. et al. Sàng lọc thông lượng cao của các thư viện enzyme. sự phát triển trong ống nghiệm của một-galactosidase bằng cách phân loại nhũ tương kép được kích hoạt bằng huỳnh quang. hóa. Sinh học. 12, 1291–1300 [2005]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Agresti, J. J. et al. Sàng lọc thông lượng cực cao trong vi lỏng dựa trên giọt cho sự tiến hóa có định hướng. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 107, 4004–4009 [2010]

  CAS  ADS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Anna, S. l. , Bontoux, N. & Đá, H. Một. Hình thành sự phân tán bằng cách sử dụng "tập trung dòng chảy" trong vi kênh. ứng dụng. vật lý. thư. 82, 364–366 [2003]

  CAS  QUẢNG CÁO  Google Scholar

• Haneoka và cộng sự. Phân loại tích cực vi lỏng của các phân tử DNA được dán nhãn bằng các chấm lượng tử đơn lẻ bằng cách sử dụng chuyển đổi dòng chảy bằng quá trình chuyển đổi sol-gel hydrogel. Thiết bị truyền động cảm biến. B-Hóa. 159, 314−320 [2011]

  CAS  Google Scholar

• Lý, W. et al. Sàng lọc ảnh hưởng của năng lượng bề mặt của vi mạch đối với quá trình nhũ hóa vi lỏng. Langmuir 23, 8010−8014 [2007]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Trưởng khoa, F. b. et al. Khuếch đại bộ gen người toàn diện bằng cách sử dụng khuếch đại đa dịch chuyển. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 99, 5261−5266 [2002]

  CAS  ADS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Nelson, J. r. Khuếch đại toàn bộ bộ gen dựa trên Phi29 DNA polymerase được mồi ngẫu nhiên. cà ri. giao ước. mol. Sinh học. 105, 15. 13. 1–15. 13. 16 [2014]

  Google học giả

• Ngõ, Đ. J. Giải trình tự 16S/23S rRNA trong Kỹ thuật axit nucleic trong hệ thống vi khuẩn [ed. Stackebrandt, E. & Bạn tốt, M. ] 115–175 [Wiley, 1991]

• Bankevich, A. et al. quân bích. một thuật toán lắp ráp bộ gen mới và các ứng dụng của nó để giải trình tự tế bào đơn. J. máy tính. Sinh học. 19, 455–477 [2012]

  CAS  MathSciNet  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Lombard, V. et al. Cơ sở dữ liệu enzyme hoạt tính Carbohydrate [CAZy] năm 2013. axit nucleic Res. 42, D490–D495 [2014]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Theberge, A. b. et al. Microdroplet trong vi lỏng. một nền tảng phát triển cho những khám phá trong hóa học và sinh học. Angew Chem. số nguyên. biên tập. tiếng anh. 49, 5846−5868 [2010]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Guo, M. t. , Rotem, A. , Heyman, J. Một. & Weitz, Đ. Một. Microfluidics nhỏ giọt cho các xét nghiệm sinh học thông lượng cao. Lab Chip 12, 2146−2155 [2012]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Najah, M. et al. Nền tảng vi lỏng dựa trên giọt nhỏ để nghiên cứu sinh học thông lượng cực cao của các vi sinh vật phân giải tế bào. hóa. Sinh học. 21, 1722−1732 [2014]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Blainey, P. C. Tương lai là đây. bộ gen đơn bào của vi khuẩn và vi khuẩn cổ. vi sinh FEMS. Tái bản. 37, 407–427 [2013]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• de Bourcy, C. F. et al. Một so sánh định lượng của các phương pháp khuếch đại toàn bộ bộ gen đơn bào. PLoS MỘT 9, e105585 [2014]

  QUẢNG CÁO  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Bhatia, Y. , Mishra, S. & Bisaria, V. S. β-glucosidase vi sinh vật. nhân bản, tính chất và ứng dụng. chí mạng. Tái bản. công nghệ sinh học. 22, 375–407 [2002]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Ketudat Cairns, J. r. & Esen, A. β-Glucosidase. tế bào mol. khoa học đời sống. 67, 3389−3405 [2010]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Kohen, E. et al. Một nghiên cứu tại chỗ về hoạt động beta-glucosidase trong nguyên bào sợi Gaucher và bình thường với các đầu dò fluorogen. hóa sinh tế bào. chức năng. 11, 167−177 [1993]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• van Es, H. h. , Veldwijk, M. , Havenga, M. & Valerio, D. Xét nghiệm tế bào học dòng chảy cho glucocerebrosidase lysosomal. hậu môn. hóa sinh. 247, 268–271 [1997]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Koster, S. et al. Các thiết bị vi lỏng dựa trên giọt để đóng gói các tế bào đơn lẻ. Lab Chip 8, 1110−1115 [2008]

  PubMed  Google Scholar

• Kim, S. J. et al. Sàng lọc và xác định đặc tính của enzyme có hoạt tính β-glucosidase từ DNA môi trường. J. vi sinh vật. công nghệ sinh học. 17, 905−912 [2007]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Jiang, C. et al. Đặc điểm của một hoạt động giống như-glucosidase mới từ một metagenome đất. J. vi sinh vật. 47, 542−548 [2009]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Jiang, C. et al. Xác định-glucosidase có nguồn gốc từ metagenome từ nội dung của lò phản ứng sinh học. J. mol. Catal. Enzym B. 63, 11–16 [2010]

  CAS  Google Scholar

• Uchiyama, T. , Miyazaki, K. & Yaoi, K. Đặc tính của một-glucosidase mới từ metagenome vi sinh vật ủ phân có hoạt tính chuyển hóa glycosyl mạnh. J. Sinh học. hóa. 288, 18325–18334 [2013]

  CAS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Sjostrom, S. l. et al. Sàng lọc thông lượng cao cho các vật chủ sản xuất enzyme công nghiệp bằng phương pháp vi lỏng nhỏ giọt. Chip phòng thí nghiệm 14, 806−813 [2014]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Kintses, B. et al. Các xét nghiệm ly giải tế bào picoliter trong các ngăn nhỏ giọt vi lỏng để tiến hóa enzyme có định hướng. hóa. Sinh học. 19, 1001−1009 [2012]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• giao dịch, K. S. & Easley, C. J. Bộ cắt mẫu dựa trên giọt nước, tự điều chỉnh để phát hiện độ hấp thụ vi lỏng. hậu môn. hóa. 84, 1510–1516 [2012]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Gielen, F. et al. Một nền tảng ngăn theo yêu cầu hoàn toàn không được giám sát dành cho các thử nghiệm nanolit chính xác về động học và ức chế enzym ở trạng thái ổn định phụ thuộc vào thời gian. hậu môn. hóa. 85, 4761−4769 [2013]

  CAS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Stevenson, R. et al. Phân tích hoạt động của enzyme nội bào bằng tán xạ Raman tăng cường bề mặt. Nhà phân tích 138, 6331–6336 [2013]

  CAS  ADS  PubMed  Google Scholar

• Hân, Z. , Lý, W. , Huang, Y. & Zheng, B. Đo động học enzym nhanh bằng phương pháp điện hóa trong thiết bị vi lỏng dựa trên giọt có van khí nén. hậu môn. hóa. 81, 5840–5845 [2009]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Lương, K. et al. Một thiết bị vi lỏng dựa trên giọt có thể lập trình được áp dụng cho phân tích đa thông số của các vi khuẩn đơn lẻ và cộng đồng vi sinh vật. Proc. tự nhiên. học viện. Khoa học. Hoa Kỳ 109, 7665−7670 [2012]

  CAS  ADS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

• Đất đai, Z. C. , Giovanonni, S. J. , Trận động đất, S. r. & Blainey, P. C. Lựa chọn tế bào optofluidic từ các cộng đồng vi sinh vật phức tạp để phân tích bộ gen đơn. Phương pháp Enzyme. 531, 61−90 [2013]

  CAS  PubMed  Google Scholar

• Pruesse, E. et al. SILVA. một nguồn tài nguyên trực tuyến toàn diện cho dữ liệu trình tự RNA ribosome được kiểm tra và căn chỉnh chất lượng tương thích với ARB. axit nucleic Res. 35, 7188–7196 [2007]

  CAS  PubMed  PubMed Central  Google Scholar

Tải tài liệu tham khảo

Sự nhìn nhận

Các tác giả cảm ơn Yoshitaka Shirasaki, Takashi Sakurai và Haruka Okada từ Đại học Tokyo đã hỗ trợ kỹ thuật và thảo luận hữu ích. Nghiên cứu này được hỗ trợ một phần bởi Trợ cấp cho các nhà khoa học trẻ [B] [15K18668 đến RI], Nghiên cứu khoa học [B] [15H04358 đến TF], Nghiên cứu khoa học [S] [23226010 đến SS] và Nghiên cứu khoa học về các lĩnh vực ưu tiên . Nghiên cứu này cũng được hỗ trợ bởi Trung tâm Chương trình Đổi mới của Cơ quan Khoa học và Công nghệ Nhật Bản và bởi một khoản tài trợ từ Quỹ Ứng dụng Enzymology Nhật Bản

thông tin tác giả

Tác giả và Chi nhánh

1. Trường Cao học Khoa học Dược phẩm, Đại học Tokyo, 7-3-1, Hongo, Bunkyo-ku, 113-0033, Tokyo, Nhật Bản

   Kazuki Nakamura, Ryo Iizuka & Takashi Funatsu

2. Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology, 2-15 Natsushima-cho, Yokosuka-shi, 237-0061, Kanagawa, Japan

   Shinro Nishi, Takao Yoshida, Yuji Hatada & Yoshihiro Takaki

3. Khoa Khoa học Nano và Kỹ thuật Nano [Trường Cao học ASE], Đại học Waseda, 3-4-1 Okubo, Shinju-ku, 169-8555, Tokyo, Nhật Bản

   Ayaka Iguchi, Dong Hyun Yoon & Shuichi Shoji

4. Research Organization for Nano & Life Innovation, Waseda University, 513, Waseda-tsurumaki-cho, Shinjuku-ku, 162-0041, Tokyo, Japan

   Tetsushi Sekiguchi

tác giả

1. Kazuki Nakamura

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

2. Ryo Iizuka

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

3. Shinro Nishi

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

4. Takao Yoshida

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

5. Yuji Hatada

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

6. Yoshihiro Takaki

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

7. Ayaka Iguchi

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

8. Dong Hyun Yoon

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

9. Tetsushi Sekiguchi

   Xem các ấn phẩm của tác giả

   Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

10. Shuichi Shoji

    Xem các ấn phẩm của tác giả

    Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

11. Takashi Funatsu

    Xem các ấn phẩm của tác giả

    Bạn cũng có thể tìm kiếm tác giả này trong PubMed   Google Scholar

Đóng góp

R. I. hình thành dự án và thiết kế các thí nghiệm; . N. thực hiện các thí nghiệm; . N. , Y. H. và Y. T. thực hiện phân tích trình tự; . Y. lấy mẫu nước biển; . I. , D. H. Y. ,T. S. và S. S. đóng góp vào việc thiết kế thiết bị vi lỏng; . F. giám sát nghiên cứu; . N. , R. I. và T. F. đã viết bản thảo. Tất cả các tác giả đã xem xét bản thảo

tuyên bố đạo đức

Lợi ích cạnh tranh

Các tác giả tuyên bố không có lợi ích tài chính cạnh tranh

Tài liệu bổ sung điện tử

Thông tin bổ sung

Quyền và quyền

Tác phẩm này được cấp phép theo Creative Commons Attribution 4. 0 Giấy phép quốc tế. Hình ảnh hoặc tài liệu của bên thứ ba khác trong bài viết này được bao gồm trong giấy phép Creative Commons của bài viết, trừ khi có quy định khác trong hạn mức tín dụng; . Để xem bản sao của giấy phép này, hãy truy cập http. //Commons sáng tạo. org/giấy phép/bởi/4. 0/

In lại và Quyền

Về bài viết này

Trích dẫn bài viết này

Nakamura, K. , Iizuka, R. , Nishi, S. et al. Phương pháp độc lập với văn hóa để xác định các gen mã hóa enzyme của vi sinh vật bằng cách giải trình tự tế bào đơn dựa trên hoạt động bằng cách sử dụng nền tảng vi giọt nước trong dầu. Đại diện khoa học 6, 22259 [2016]. https. //doi. tổ chức/10. 1038/srep22259

Tải xuống trích dẫn

• Đã nhận . 14 tháng 10 năm 2015

• Được chấp nhận . 10 tháng 2 năm 2016

• Đã xuất bản . 26 tháng 2 năm 2016

• DOI . https. //doi. tổ chức/10. 1038/srep22259

Chia sẻ bài viết này

Bất kỳ ai bạn chia sẻ liên kết sau đều có thể đọc nội dung này

Xin lỗi, một liên kết có thể chia sẻ hiện không có sẵn cho bài viết này

Sao chép vào clipboard

Được cung cấp bởi sáng kiến ​​chia sẻ nội dung Springer Nature SharedIt

Bài viết này được trích dẫn bởi

• Báo cáo SHP phiên 2—giải mã kiến ​​trúc nội bào bằng cách sử dụng trực quan quá trình phát triển thiết bị và mô hình toán học

  • Akira Kitamura
  • Kazuya Kabayama

  Đánh Giá Lý Sinh [2020]

• Xây dựng chip logic gen tích hợp

  • Takeya Masubuchi
  • Masayuki Endo
  • Hisashi Tadakuma

  Công Nghệ Nano Thiên Nhiên [2018]

• Phát triển một nền tảng phân lập đơn bào dựa trên giọt nước dễ dàng để nuôi cấy và phân tích bộ gen ở vi sinh vật

  • Qiang Zhang
  • Tingting Wang
  • Bo Ma

  Báo cáo khoa học [2017]

Bình luận

Bằng cách gửi nhận xét, bạn đồng ý tuân thủ Điều khoản và Nguyên tắc cộng đồng của chúng tôi. Nếu bạn thấy nội dung nào đó lạm dụng hoặc không tuân thủ các điều khoản hoặc nguyên tắc của chúng tôi, vui lòng gắn cờ nội dung đó là không phù hợp

Làm thế nào bạn có thể xác định vi khuẩn mà không cần nuôi cấy?

Vi khuẩn không nuôi cấy là gì?

Làm thế nào các vi sinh vật có thể được xác định ở cấp độ nuôi cấy?

Các loại phương pháp nuôi cấy là gì?