Sắc ký lỏng hiệu năng cao [High Performance Liquid Chromatography] là một phương pháp phân tích hóa lý, dùng để chia tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh [trong cột sắc ký] và pha động [dung môi rửa giải]. Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích đưa vào cột, chúng sẽ được hấp thụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy thuộc vào bản chất của cột của chất cần phân tích. Khi bơm dung môi pha động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi đầu dò [detector] và được chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng là sắc ký đồ và peak sẽ được xuất ra màn hình.
Sắc ký lỏng [LC] được định nghĩa vào đầu những năm 1900 bởi công trình của nhà thực vật học Nga, Mikhail Semyonovich Tsvet. Nghiên cứu tiên phong của ông tập trung vào việc tách các hợp chất [sắc tố lá], chiết xuất từ thực vật bằng cách sử dụng một dung môi, trong cột được nhồi bằng các hạt [Belanger, Paré, and Sigouin 1997].
Đến năm 1970 Giáo sư Csaba Horváth đã chỉ ra rằng áp suất cao được sử dụng để tạo ra dòng chảy qua cột sắc ký. Ban đầu, máy bơm chỉ có áp suất 500 psi [35 bar]. Điều này được gọi là sắc ký lỏng áp suất cao [High Performance Liquid Chromatography], hoặc HPLC. Đầu những năm 1970 đã chứng kiến một bước tiến lớn trong công nghệ. Những thiết bị HPLC mới có thể tạo ra áp suất tới 6.000 psi [400 bar] và kết hợp các kim tiêm mẫu, đầu dò và cột cải tiến. HPLC thực sự được sử dụng nhiều vào giữa những năm 1970. Với những tiến bộ liên tục về hiệu suất trong thời gian này [hạt nhồi nhỏ hơn, thậm chí áp suất cao hơn] [Belanger, Paré, and Sigouin 1997].
- Các bộ phận chính của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sơ đồ cấu tạo của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao điển hình được trình bày trong Hình 2.2.
Hình 2.2 Cấu tạo hệ thống HPLC [Chheda 2014]
Bình chứa dung môi [1]: thường có 4 kênh dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng 1 lần để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của 4 kênh là 100%. Tất cả hóa chất sử dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và phải lọc qua màng lọc 0.22 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền.
Bộ phận loại khí [2]: mục đích sử dụng bộ loại khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như các bọt khí còn sót lại trong khi phân tích thì sẽ xảy ra các hiện tượng không mong muốn như tỷ lệ pha động của các kênh dung môi bị sai lệch làm cho thời gian lưu của peak thay đổi. Tuy nhiên dung môi đã được đánh sóng âm để loại bỏ bọt khí trước khi được đưa vào sử dụng.
Bơm cao áp [3]: mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạo áp suất cao khoảng 250 – 500 atm [1 atm = 0.98 bar] và phải tạo dòng liên tục.
Bộ phận tiêm mẫu [4]: nhằm để đưa mẫu vào cột phân tích với dung tích của lớp là 5 – 100 µL.
Cột sắc ký [5] được xem như trái tim của hệ thống. Nó chứa pha tĩnh, được làm bằng thép không rỉ với mặt trong của cột được làm nhẵn. Có nhiều loại cột sắc ký khác nhau tùy vào mục đích sử dụng. Thông thường cột sắc ký được chia làm 2 loại [theo khối lượng nguyên tử]: loại có khối lượng phân tử nhỏ [5000 Dalton]. Đối với tính tan của chất cần phân tích gồm có chất phân cực [tan trong nước] và không phân cực [tan trong dung môi]. Về phương pháp tách cột sắc ký lại được chia ra các loại cột khác nhau như:
- Sắc ký hấp phụ pha thuận và pha đảo [pha tĩnh là chất hấp phụ]: NP – HPLC và RP – HPLC.
- Sắc ký trao đổi ion [pha tĩnh là chất trao đổi ion]: IE – HPLC.
- Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết [pha tĩnh là chất lỏng]: LLC.
- Sắc ký gel hay rây phân tử [pha tĩnh là gel]: IG – HPLC.
Đầu dò [6]: bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Những đặc trưng quan trọng của đầu dò trong HPLC là độ nhạy, đáp ứng chọn lọc hoặc thông dụng, đáp ứng không bị tác động bởi những thay đổi của các điều kiện, thể tích chết thấp, không dễ bị phá hủy, rẻ tiền đáng tin cậy và dễ sử dụng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dò thích hợp.
- Đầu dò khúc xạ [chiết suất vi sai] thường dùng đó các loại đường.
- Đầu dò điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn.
- Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt
- Đầu dò quang phổ tử ngoại 200 – 380 nm để phát hiện UV
- Đầu dò UV – VIS có bước sóng từ 190 – 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và là loại thông dụng nhất.
- Đầu dò huỳnh quang [RF] để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên như các chất dẫn có huỳnh quang. Là loại đầu dò có độ chọn lọc cao nhất.
- Và loại hiện đại nhất là đầu dò DAD [Diode Array Detector] có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất.
Bộ ghi nhận tín hiệu [7]: bộ phận này ghi nhận tín hiệu do đầu dò phát hiện, với các hệ thống hiện đại phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ… Đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích.
In dữ liệu [8]: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.
- Ứng dụng của hệ thống HPLC
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng được dùng để phân tích: các chất bảo quản, phụ gia, các hợp chất thuốc trừ sâu. Phân tích dư lượng thuốc kháng sinh, độc tố vi nấm trên nông sản, thức ăn chăn nuôi. Và định lượng chất chất lượng nước giải khát và nước.
Vì ưu điểm của phương pháp này có độ nhạy cảm cao, có khả năng định lượng tốt, mức độ chính xác cao, đặc biệt thích hợp để tách các chất khó bay hơi và các chất dễ bị phân hủy nhiệt nên nó được sử dụng khá nhiều cho những mục đích sản xuất, nghiên cứu thí nghiệm, pháp lý và y dược.
- Tổng quan về đầu dò mảng Diode [DAD]
- Giới thiệu về đầu dò
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được ghép nối với đầu dò UV–VIS , DAD, MS, FLD, … Tuy nhiên, hai đầu dò UV–VIS và DAD được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn.
Đầu dò UV sử dụng đèn phóng điện Deuterium [đèn D2] làm nguồn sáng, với bước sóng ánh sáng của nó nằm trong khoảng từ 190 đến 380 nm. Nếu các thành phần được phát hiện ở bước sóng dài hơn bước sóng này, đầu dò UV–VIS bổ sung thêm đèn Wolfram [đèn W].
Đầu dò DAD có các mảng diode quang [thiết bị bán dẫn] được sử dụng trong bộ phát hiện. Đầu dò DAD có bước sóng nằm trong vùng 190 – 900 nm. Trong khi đầu dò UV-VIS chỉ có một phần tiếp nhận ánh sáng ở phía mẫu, thì DAD có nhiều mảng diode quang [1024 hoặc 512] để thu được thông tin trên một loạt các bước sóng cùng một lúc.
Ở đầu dò DAD, nếu phép đo được thực hiện ở bước sóng cố định, các thành phần chỉ được xác định từ thời gian lưu của chúng. Do đó, một sai lệch nhỏ về thời gian lưu có thể gây khó khăn cho việc xác định các thành phần. Trong trường hợp này, DAD có thể được sử dụng để xác định các thành phần bằng cách so sánh phổ.
Đầu dò DAD khác với đầu dò UV-VIS ở chỗ ánh sáng từ đèn được chiếu trực tiếp vào tế bào dòng chảy, ánh sáng đi qua tế bào dòng chảy bị phân tán bởi cách tử nhiễu xạ và lượng ánh sáng phân tán được ước tính cho mỗi bước sóng trong mảng diode quang. Đầu dò DAD thu thập cả thông tin thời gian [sắc ký đồ] cũng như thông tin phổ [phổ UV], nên có thể giải mã dữ liệu và xác định số lượng của mỗi chất phân tích trong một peak đồng rửa giải.
Đầu dò DAD có ưu điểm là phân biệt giữa các chất phân tích có phổ hấp thụ khác nhau và dạng phổ có thể hỗ trợ việc xác định peak chưa biết trên sắc đồ. Để xác nhận đầy đủ, các phép phân tích phải được thực hiện bằng phương pháp khối phổ. DAD thường được sử dụng để xác định độ tinh khiết đỉnh của hợp chất mục tiêu. Phổ độ hấp thụ được so sánh tại nhiều điểm trên đỉnh để tìm điểm giống và khác nhau. Phần mềm thực hiện việc nâng vật nặng lên, chỉ số độ tinh khiết của đỉnh được tạo ra có thể cho biết liệu nhiều hợp chất có thể đồng rửa giải hay không.
Tuy nhiên DAD vẫn có các nhược điểm như nhiễu lớn do lượng ánh sáng nhỏ; DAD cũng dễ bị ảnh hưởng bởi các thay đổi khác nhau, chẳng hạn như dao động của đèn, vì không thể nhận được ánh sáng tham chiếu.
- Nguyên tắc hoạt động
DAD có có hai nguồn sáng – đèn wolfram là nguồn của ánh sáng nhìn thấy và đèn deuterium là nguồn của ánh sáng tử ngoại [UV].
Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của DAD
Cả 2 nguồn sáng được hợp làm một và được chiếu trực tiếp vào tế bào dòng chảy [Hình 2.3], ánh sáng đi qua tế bào dòng chảy bị phân tán bởi cách tử nhiễu xạ và lượng ánh sáng phân tán được ước tính cho mỗi bước sóng trong mảng diode quang [Özdemir et al. 2020].
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò mảng diode [HPLC – DAD]
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò mảng diode [HPLC – DAD] [Hình 2.4] là hệ thống sắc ký lỏng với các tính năng vận hành mạnh mẽ, với độ chính xác, an toàn cao. Hệ thống được áp dụng nhiều công nghệ tiên tiến. Hệ thống bơm, bộ tiêm mẫu tự động chịu được áp suất rất cao, lên đến 62 MPa [9.000 psi].
Hệ thống dễ dàng nâng cấp cài đặt, phần mềm dễ dàng nhận dạng các module thiết bị gắn thêm vào hệ thống. Và dễ dàng nâng cấp lên hệ thống sắc ký lỏng ghép nối khối phổ.
Cột HPLC là gì?
Cột HPLC là thành phần chính trong hệ thống sắc ký lỏng vì nó chịu trách nhiệm phân tách các chất phân tích trong mẫu. Việc bảo vệ và chăm sóc cột không chỉ giúp chúng ta thu được kết quả phân tích đáng tin cậy mà còn đảm bảo quy trình vận hành không gặp bất kỳ sự cố nào.
Cột sắc ký ODS là gì?
Cột sắc ký lỏng YMC-Pack™ ODS-AQ là cột pha đảo bản quyền với carbon-load kỵ nước cao và bề mặt tương đối ưa nước. Do bề mặt ưa nước, ODS-AQ có thể được “làm ướt” bằng dung dịch rửa giải phân cực.
Cột C18 HPLC là gì?
C18 HPLC được sử dụng rộng rãi trong khoa học môi trường, công nghiệp dược phẩm, phòng thí nghiệm phân tích phóng xạ và phân tích hóa học. Chúng được sử dụng để phân tích các phần riêng lẻ của hỗn hợp hóa học hoặc các phân tử được dán nhãn / dán nhãn phóng xạ.
Pha tĩnh là chất gì?
- Pha tĩnh là vật liệu trao đổi ion chứa trong cột thủy tinh thường là chất trơ, không tan trong nước. Vật liệu trao đổi ion được sử dụng nhiều nhất là các ionit hữu cơ tổng hợp chứa nhựa trao đổi ion. Các chất trao đổi ion có giá thể là cellulose, sephadex, molselect thường dùng để tách protein.