II. VI KHUẨN 1. Hình thái, kích thước và nhuộm màu Vi khuẩn có nhiều hình thái khác nhau, kích thước và cách sắp xếp khác nhau. Đường kính vi khuẩn khoảng 0,2 – 2,0 micromet, chiều dài cơ thể khoảng 2 – 8 micromet. Hình dạng chủ yếu của vi khuẩn là hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn,… Tế bào vi khuẩn rất nhỏ, trong suốt nên khi soi dưới kính hiển vi chỉ thấy được đại thể về hình dạng và tình trạng di động. Muốn quan sát kỹ hơn phải tiến hành nhuộm màu. Có nhiều phương pháp nhuộm màu trong đó đáng chú ý là phương pháp nhuộm Gram do Hans Christian Gram tìm ra năm 1884. * Phương pháp nhuộm vi khuẩn sống Phương pháp nhuộm Gram do nhà vi khuẩn học Đan Mạch Hans christian Gram [1853 – 1938] phát minh ra từ đầu năm 1884. Nhờ phương pháp này có thể phân biệt vi khuẩn thành hai nhóm lớn: Vi khuẩn Gram dương [Gram – positive] và vi khuẩn Gram âm [Gram – negative] Phương pháp nhuộm Gram được tiến hành như sau: - Cố định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa - Nhuộm thuốc bằng dung dịch tím tinh thể [crystal violet] trong khoảng 1 phút sau đó rửa bằng nước cất - Nhuộm tiếp bằng dung dịch Iot [dung dịch Lugol] trong khoảng 1 phút sau đó rửa lại bằng nước cất - Phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95% : axeton [1:1] trong khoảng 1 phút sau đó rửa lại bằng nước cất - Nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu đỏ [như safranin hay Fuchsin Ziehl] trong khoảng 30 đến 60 giây sau đó rửa bằng nước cất - Để khô và soi kính Kết quả như sau: Nhóm Gram dương có đặc tính không bị dung môi hữu cơ Etanol, Axeton tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và Iot. Kết quả là màu tím Nhóm Gram âm bị dung môi hữu cơ tẩy màu thuốc nhuộm ban đầu do đó sẽ bắt màu với thuốc nhuộm bổ sung [đỏ vàng với Safranin, đỏ tía với Fuchsin]. 2. Thành tế bào [cell wall] Lớp cấu trúc ngoài cùng có vai trò: - Duy trì ngoại hình của tế bào - Hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao - Giúp tế bào vi khuẩn đề kháng với các tác động từ bên ngoài như áp suất thẩm thấu. - Cần thiết cho quá trình phân cắt bình thường của tế bào - Cản trở sự xâm nhập vào tế bào của một số chất có hại - Liên quan mật thiết với tính kháng nguyên, tính gây bệnh, chẳng hạn như khả năng sinh nội độc tố, tính mẫn cảm với thể thực khuẩn. Thành phần cấu tạo của thành tế bào rất phức tạp. Giữa Gram dương và Gram âm có nhiều khác nhau. Hai nhóm vi khuẩn Gram dương và Gram âm có các đặc điểm khác nhau cơ bản
Thành phần Tỉ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn G+ G- Peptidoglican Axit teicoic Lipoit Protein 30 – 95 Cao Hầu như không có Không có hoặc ít 5 – 20 0 20 cao Trong quá trình nhuộm Gram tế bào trước hết được xử lý với tím tinh thể [crystal violet] rồi với Iot. Kết quả là có sự tạo thành phức chất tím tinh thể - Iot bên trong tế bào. Khi phủ lên dung môi hữu cơ Etanol, Axetol thì vi khuẩn Gram âm bị tẩy, lipit của lớp màng ngoài bị tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - Iot và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm này [màu đỏ vàng với Safranin, đỏ tía với Fuchsin].Đối với nhóm gram dương dung môi hữu cơ Etanol, Axetol làm cho các lỗ trong Peptidoglican co lại do đó phức chất tím tinh thể - Iot bị giữ lại trong tế bào./. Vai trò của các thành phần trên như sau - Peptidogican là loại polime xốp, không tan, khá cứng và bền vững bao quanh tế bào như một mạng lưới. Cấu trúc cơ bản của peptidoglican gồm 3 thành phần: + N – axetylglucozamin + Axit N – axetylmuramic + Tetrapeptit chứa cả L và D axit amin Để tạo thành mạng lưới cứng, Tetrapeptit trên mỗi chuỗi peptidoglican [PG] liên kết chéo với các Tetrapeptit trên chuỗi khác. Đồng thời các thành phần của lưới phải được liên tục mở ra bởi các enzym autolizin để polime mới có thể lắp thêm vào và tế bào có thể sinh trưởng và phân cắt. Ở vi khuẩn Gram âm lớp ngoài cùng của thành tế bào là 2 lớp lipopolisaccarit đan xen với các phân tử protein có chức năng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác. Thành tế bào có thể cho các chất dinh dưỡng đi qua nhưng lại có thể ngăn cản các chất độc hại. Thành tế bào của vi khuẩn Gram dương có thể bị phá hủy hoàn toàn để trở thành thể nguyên sinh khi chịu tác động của Lizozim. Thành tế bào Gram âm có sức đề kháng tốt hơn với lizozim nên bị phá hủy ít hơn với lizozim. Vi khuẩn Gram dương có tới 50% khối lượng khô của thành tế bào là peptidoglican trong khi đó Gram âm tỷ lệ này khoảng 5 – 10% - Axit teicoic : thành phần đặc trưng của thành tế bào vi khuẩn Gram dương. Là polime của ribitol và glixerol photphat liên kết với PG hoặc màng tế bào chất. Do tích điện âm axit teicoic giúp cho việc vận chuyển các ion dương vào, ra tế bào và giúp tế bào dự trữ photphat. Ngoài ra teicoic còn liên quan đến kháng nguyên bề mặt và tính gây bệnh của một số vi khuẩn Gram dương [gọi là thụ thể hấp thụ được biệt đối với một số thể thực khuẩn]. - Lipoit : Vi khuẩn Gram âm có thành phần LPS [lipopolisaccrit] dày khoảng 8 – 10nm và cấu tạo bởi 3 thành phần : + Lipit A : 2 phân tử N – axetylglucozamin, 5 chuỗi dài axit béo + polisaccarit lõi gồm vùng lõi trong là 3 phân tử KDO [ketodexyoctulosomic acid], 3 phân tử Hep [L – Glixerin – D – heptose] và vùng lõi ngoài là các phân tử hexose [gồm glucozamin, galactose, glucose] + Kháng nguyên O : phần polisaccarit vươn khỏi màng vào môi trường gồm các phân tử Hexose Phần Lipit A là nội độc tố của vi khuẩn gây ra sốt, tiêu chảy, phá hủy hồng cầu và dẫn đến sốc. Kháng nguyên O quyết định nhiều đặc tính huyết thanh của vi khuẩn có chứa LPS và là thụ thể của thể thực khuẩn. - Protein : gồm các loại cơ bản sau + Protein cơ chất như porin ở vi khuẩn E.coli còn gọi là protein lỗ nằm xuyên suốt qua màng ngoài và cho phép đi qua chúng một số loại phân tử như đường, axit amin, dipeptit, các ion vô cơ,.. + Protein màng ngoài chức năng vận chuyển chuyên biệt một số phân tử khá lơn và đưa chúng đi qua màng ngoài như vitamin B12, nucleotit,… + Lipoprotein có vai trò liên kết giữa PG bên trong với lớp màng ngoài.